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不同色譜柱和不同批次之間的重現(xiàn)性

 問：我要開始開發(fā)一個新的HPLC方法。驗證之后，該方法將轉(zhuǎn)道QC實驗室并將使用許多年。我擔(dān)心該方法的長期的重復(fù)性，特別是柱子的長期重復(fù)性。怎樣才能確保好的重復(fù)性呢？

答：首先，我要表揚你在開始做這個方法的時候就能考慮到這個方面。如果可以預(yù)料到該方法將要使用好幾年，在選擇柱子方面就要做些功課。要想使柱子在該方法的可預(yù)見的適用期內(nèi)使用，就要選擇一些大的生產(chǎn)廠家。另外，要選擇一種標(biāo)準(zhǔn)的表面化學(xué)物質(zhì)（比如C18或C8）而不是那些新奇的或很少使用的。

下一個標(biāo)準(zhǔn)才是柱子的重復(fù)性，如果你或你的同事以前用過一根柱子有很好的重復(fù)性，這是一個很好的起點，同時也要考慮生產(chǎn)商提供的信息。近來有的廠家開始印刷他們的說明和不同批次的重復(fù)性實驗的結(jié)果。你可以從廠家得到這些信息然后細(xì)心對照。

 問：我該從這些信息中尋找什么呢？

答：我們先來解釋一下不同柱子和批次之間重復(fù)性的不同方面。下面就說一下反相填料，因為他們更加普遍。

如果你用同一批填料的不同柱子，將會得到不同的塔板數(shù)（峰寬），不同的柱壓，不同的保留時間。保留時間與填料密度和柱體積呈比例改變，而柱體積則取決于柱子的內(nèi)徑。這個改變對你的方法應(yīng)該是沒什么影響的，因為所有峰的保留時間都呈比例的改變，而分離度還是沒變。這個原因?qū)е碌谋Ａ魰r間變化的RSD通常在3%左右，但是如果生產(chǎn)商對柱子的硬件有很好的控制，RSD也可以低到1%。柱子塔板數(shù)的變化會影響方法，特別是做雙峰的時候，它們很少能達(dá)到基線分離的。盡管2-3%的塔板數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差已經(jīng)可以達(dá)到，但通常還是在±10%，記住塔板數(shù)是個平方數(shù)，分離度僅僅取決于塔板數(shù)的根。所以塔板數(shù)2%的偏差相當(dāng)于峰寬1%的偏差。你要確認(rèn)一下柱子的廠家是有塔板數(shù)的上下限，還是只有一個下限，上下限都有比較讓人滿意。

同一裝填程序的柱子其柱壓的重復(fù)性是相當(dāng)好的，同一批次變化應(yīng)不超過±5%。 

 問：那么批次之間的重復(fù)性怎么樣呢？

答：如果你注意一下批次間的色譜參數(shù)，你會發(fā)現(xiàn)同參數(shù)會不同，更重要的是批次間分離的選擇性也會改變。就是說峰的相對保留會改變，比如他們在色譜圖中的相對位置，這對你方法的確定性是不利的。

這種改變是你要盡量避免的，所以你要從廠家那里得到一些消息，他們是怎么確保批次之間重復(fù)性的，這包括一些物理，化學(xué)，色譜方面的測試。在物理測試中，更重要的一項是裝填的表面積，該項參數(shù)的變化會直接導(dǎo)致保留時間的變化。所以你要知道廠家認(rèn)可的批次間表面積改變的幅度是多少。通常情況下幅度是±10%，但是±5%也是可以達(dá)到的。化學(xué)方面的參數(shù)更重要的是鍵合相的表面覆蓋率。通常用多少μmol/m² 表示。許多廠家并沒有直接給出這個參數(shù)，而只說明了C的百分含量。我們希望看到的這個代替性的說明以及一個緊湊的幅度，通常是±10%，低于±4%的也可以達(dá)到。

更后你要知道廠家的色譜重復(fù)性測試，通常色譜柱會附帶一張色譜圖，檢測的是一些簡單的中性化合物的混合物，例如甲苯，萘和蒽等。但是這不是一個好的批次間重復(fù)性測試。因為這些中性疏水化合物的相對保留重復(fù)性相當(dāng)好，對裝填中表面覆蓋率的改變是相當(dāng)不敏感的。好的批次間重復(fù)性測試還應(yīng)在混合物中添加強(qiáng)堿化合物。在精心設(shè)計的測試中，精選的堿性化合物主要與殘余硅羥基作用，而中性化合物則主要與鍵合相作用。只有含有2種化合物的重復(fù)性測試才是讓人信服的。如果一個廠家是這樣測試的并且有好的重復(fù)性，那么他的柱子會更加讓人放心。 

 問：我不知道廠家的測試與我的化合物的檢測有什么聯(lián)系，我應(yīng)該怎樣在我的檢測中確保一個好的批次間重復(fù)性呢？

答：你說的很對，上面的消息只能讓你有一個比較大的機(jī)會確保重復(fù)性。但更后必須用你自己的檢測來做重復(fù)性測試。有些廠家提供一整套的設(shè)備包括不同裝填批次的柱子來做這個測試，另外有的廠家則按要求提供不同批次的柱子，你要了解你所得到的東西。同一裝填批次的色譜柱是沒有用的，你需要的是用不同鍵合反應(yīng)裝填的柱子。如果同一批次是不同天內(nèi)裝填，然后色譜柱編號又不同的時候的時候，你更好詢問2次，確保廠家給你的是你要的。

你需要3根不同批次的色譜柱來為你的方法做重復(fù)性測試。如果批次間的改變不影響你的檢測，那么接下來的時間你的方法應(yīng)該有一個好的重復(fù)性。